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PCR方法在蘄蛇中的鑒別實(shí)踐論文
近年來(lái)，由于大量的捕捉和利用蘄蛇，使蘄蛇藥材資源不斷減少，造成了藥材資源短缺，價(jià)格不斷上升，市場(chǎng)上隨之出現(xiàn)了大量的偽品。因此，對(duì)蘄蛇的鑒定已成為保證藥材質(zhì)量的關(guān)鍵。蘄蛇傳統(tǒng)的鑒別方法以形態(tài)學(xué)為主，但從形態(tài)學(xué)技術(shù)方面鑒別需要豐富的經(jīng)驗(yàn)積累和對(duì)蘄蛇的完整性要求較高，并且對(duì)不同品系的蘄蛇鑒別存在一定的困難。隨著生物學(xué)的發(fā)展，許多生物學(xué)方法也應(yīng)用于蘄蛇的鑒別，為蘄蛇的鑒別開(kāi)拓了新的領(lǐng)域。本文就PCR方法對(duì)蘄蛇的鑒別應(yīng)用作一介紹如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 試驗(yàn)藥材
蘄蛇對(duì)照品來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：121592-201201)，蘄蛇1(蘇州雷允上藥業(yè)有限公司贈(zèng)送)，蘄蛇2、赤練蛇、中國(guó)水蛇(本所保存，蛇的種類(lèi)經(jīng)本所兩位專(zhuān)家從形態(tài)學(xué)確認(rèn))。
1.1.2 儀器與試劑
高速低溫離心機(jī)(Thermo scientificBiofuge primo R)，凝膠成像系統(tǒng)(GEL DocTM XR+BioRAD)，電泳儀(Bio-RAD Power Pac TM Basic)，PCR儀(ABApplied Biosystems)。DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit，吸附柱批號(hào)：M1104)，DREAM Taq Green PcrMaster Mix(2×)(Thermo Scientific公司產(chǎn)品，批號(hào)：00108596)，引物合成于上海生工(批號(hào)：9301839997 和9301839996)，GelRed (購(gòu)自BIOTIUM 公司，批號(hào)：11G0127)，100bp DNA Ladder(TIANGEN公司產(chǎn)品)。
1.2 方法
1.2.1 模板DNA提取
(1)供試品DNA制備：取剪碎的蛇肉0.5g，置乳缽中，加液氮適量，充分研磨成粉末，取20mg置1.5ml離心管中，按DNA提取試劑使用說(shuō)明書(shū)步驟提取DNA，提取得到的供試品DNA置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(2)對(duì)照品DNA制備：取蘄蛇對(duì)照品20mg置1.5ml離心管中，按上述方法提取蘄蛇對(duì)照品DNA。
1.2.2 PCR反應(yīng)
鑒別引物：5'GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT'3 和5'CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC'3。PCR反應(yīng)體系：在200μl離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為25μl，DREAM Taq Green Pcr Master Mix12.5μl，20μM的引物各0.75μl，DNA模板1.25μl，去離子水9.75μl。PCR反應(yīng)參數(shù)95℃預(yù)變性5min，循環(huán)反應(yīng)30次(95℃30s，63℃45s)，72℃延伸5min。
1.2.3 電泳檢測(cè)
電泳緩沖液為T(mén)AE，膠濃度為1.2%，在融化的瓊脂糖中加入核酸膠染色劑GelRed;供試品與對(duì)照藥材PCR反應(yīng)溶液的上樣量分別為8μl，DNA分子量標(biāo)記上樣量為6μl，5V/cm，電泳時(shí)間約50min。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上檢視。
1.3 結(jié)果判斷
凝膠電泳圖譜中，蘄蛇正品在與對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上(291bp)有單一DNA條帶。
2 結(jié)果
蘄蛇對(duì)照品及蘄蛇正品出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增條帶，而蘄蛇混淆品(偽品)未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。
3 討論
目前，蘄蛇鑒別的經(jīng)典方法為形態(tài)學(xué)，但需要有豐富的經(jīng)驗(yàn)，而且市售的蘄蛇藥材部分是經(jīng)過(guò)醋炙的蘄蛇段，失去個(gè)體的完整性，更利于不法商販進(jìn)行制假、摻假，以大量的混淆品來(lái)充當(dāng)正品蘄蛇。由于藥材在醋炙過(guò)程中外觀形態(tài)、皮和骨骼等均可發(fā)生不同程度的改變，因此給蘄蛇藥材性狀鑒別帶來(lái)了較大的困難。本文按《中國(guó)藥典》的方法，選用了2條不同來(lái)源的正品蘄蛇及蘄蛇常見(jiàn)混淆品(中國(guó)水蛇、赤練蛇)和蘄蛇對(duì)照藥材進(jìn)行了PCR鑒定，結(jié)果該方法能夠準(zhǔn)確鑒別蘄蛇正品和混淆品。本研究顯示，用PCR的方法鑒別能夠更好地克服傳統(tǒng)方法的弊端，對(duì)蘄蛇類(lèi)藥材的炮制品在DNA水平上進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。PCR方法鑒別不依賴(lài)經(jīng)驗(yàn)和蛇的完整性，判斷結(jié)果更加直觀、客觀、可靠，該法對(duì)藥材分子鑒別具有快速、準(zhǔn)確、易于操作的優(yōu)點(diǎn)。
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