靶向Nrf2基因RNA干擾真核表達載體的構(gòu)建

目的:利用pSUPER載體構(gòu)建針對人核因子E2 p45相關(guān)因子2(Nrf2)基因的RNA干擾真核表達載體,為研究Nrf2基因在結(jié)腸癌化學預防中的作用奠定實驗基礎(chǔ).方法:設(shè)計特異性針對Nrf2基因的寡核苷酸序列及相應的對照序列,構(gòu)建重組載體pSUPER-Nrf2轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HT-29細胞.同時轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒,通過熒光顯微鏡觀察及流式細胞儀檢測綠色熒光監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率,共轉(zhuǎn)染pEGFP-N1 48h后G418篩選穩(wěn)定表達的細胞.RT-PCR和Western blot檢測瞬時及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞Nrf2基因的表達,觀察穩(wěn)定篩選出的細胞中UGT1A基因mRNA水平的表達變化.結(jié)果:成功構(gòu)建RNA干擾真核表達載體pSU-PER-Nrf2.轉(zhuǎn)染后24～96 h,熒光顯微鏡及FCM檢測顯示轉(zhuǎn)染效率為30%～75%.瞬時轉(zhuǎn)染pSUPER-Nff2-A2,pSUPER-Nrf2-B2重組質(zhì)粒Nrf2 mRNA的表達差異無顯著性(P＞0.05);瞬時轉(zhuǎn)染72 h及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后,pSUPER-Nrf2-A1,pSUPER-Nrf2-B1可顯著抑制Nrf2基因的表達.RT-PCR檢測顯示,穩(wěn)定篩選出的細胞中UGT1A表達水平降低(P＜0.05).結(jié)論:成功構(gòu)建了Nrf2的RNA干擾表達載體,篩選并獲得低表達Nrf2基因的穩(wěn)定克隆,篩選出的細胞UGT1A表達水平明顯降低,表明Nrf2可能對UGT1A酶的表達具有調(diào)節(jié)作用.

作 者： 楊曉云 李延青 梁曉紅 郭玉婷 袁俊華 張燕 朱強 YANG Xiao-yun LI Yan-qing LIANG Xiao-hong GUO Yu-ting YUAN Jun-hua ZHANG Yan ZHU Qiang   作者單位： 楊曉云,李延青,郭玉婷,袁俊華,張燕,朱強,YANG Xiao-yun,LI Yan-qing,GUO Yu-ting,YUAN Jun-hua,ZHANG Yan,ZHU Qiang(山東大學,齊魯醫(yī)院消化內(nèi)科,山東,濟南,250012)

梁曉紅,LIANG Xiao-hong(山東大學,免疫學研究所,山東,濟南,250012) 

刊 名： 山東大學學報（醫(yī)學版）  ISTIC PKU 英文刊名： JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)  年，卷(期)： 2006 44(4)  分類號： Q786  關(guān)鍵詞： 基因,Nrf2   尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶   RNA干擾   結(jié)腸腫瘤  

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