蛋白提取步驟

蛋白提取步驟

準(zhǔn)備裂解液、蛋白酶抑制劑。

1、取2mlEP管加入500ul裂解液（已加入蛋白酶抑制劑）

2、取0.1g組織，充分剪碎后加入研磨器中，加入適量液氮，將組織研成粉末狀。

3、將研磨后的組織轉(zhuǎn)至加有裂解液的2mlEP管中。

4、冰上超聲（超聲3s，停6s）共計(jì)20個(gè)循環(huán)，30%能量。

5、冰上靜置30min，每10min震蕩1次。

6、12000rpm，4℃離心30min。

7、收集上清，測(cè)濃度后-70℃保存。

8、煮蛋白時(shí)加5微升上樣緩沖液。

2．培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）：

⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。

⑵ 加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。

⑷ 12000g離心，4℃，2min。

⑸ 取少量上清進(jìn)行定量。

⑹ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

3．組織：

⑴ 勻漿 對(duì)于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動(dòng)或電動(dòng)勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。

⑵ 12000g離心，4℃，2min。

⑶ 取少量上清進(jìn)行定量。

⑷ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

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