蛋白提取實驗步驟

　　在學(xué)習(xí)、工作生活中，報告不再是罕見的東西，通常情況下，報告的內(nèi)容含量大、篇幅較長。為了讓您不再為寫報告頭疼，下面是小編幫大家整理的蛋白提取實驗步驟，歡迎大家分享。

　　蛋白提取實驗步驟：

　　1、細胞總蛋白提取

　　A、對于懸浮細胞: 離心收集細胞，每106細胞加250 ul RIPA（在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），振蕩。如果需要提高蛋白濃度，可以適當減少細胞總蛋白提取試劑體積。

　　B、對于貼壁細胞:

　　a、用TBS沖洗細胞2-3次。最后一次徹底吸干殘留液。

　　b、加入適當體積的 RIPA（使用前數(shù)分內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）于培養(yǎng)板、瓶內(nèi)3-5分鐘。期間反復(fù)晃動培養(yǎng)板、瓶，使試劑與細胞充分接觸。

　　c、用細胞刮刀將細胞及試劑刮下，收集到1.5ml離心管中。

　　C、冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細胞完全裂解。

　　D、12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

　　2、組織蛋白提�。�

　　A、組織塊用冷TBS洗滌2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）冰上徹底勻漿。如果需要提高蛋白濃度，可以適量減少該試劑體積。

　　B、將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細胞完全裂解。

　　C、12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

　　注意事項

　　1、組織盡可能新鮮，若不能及時提蛋白，組織標本應(yīng)保存在-80℃冰箱，并避免反復(fù)凍融。

　　2、全程必須在冰上進行，避免蛋白降解。

　　3、蛋白酶抑制劑在水溶液中不穩(wěn)定，需在RIPA使用前數(shù)分鐘加入蛋白酶抑制劑。

　　4、裂解過程中如有溶液粘稠現(xiàn)象可用移液器（200μl）反復(fù)吹打，或再加入適量裂解液以保證充分裂解。

　　5、總蛋白溶液不穩(wěn)定（蛋白酶依舊有活性）可在-80℃短時間保存，建議立即加入蛋白上樣緩沖液變性后與-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

　　蛋白質(zhì)的分類，從來源上可以分為動物蛋白質(zhì)、植物蛋白質(zhì)；從營養(yǎng)學(xué)上可以分為完全蛋白質(zhì)、半完全蛋白質(zhì)、不完全蛋白質(zhì)。

　　1.來源分類

　　（1）動物性蛋白質(zhì)：主要包括一些動物的肉類（比如牛肉、豬肉、魚肉、雞肉等）以及蛋類（雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋等）、奶產(chǎn)品（牛奶、羊奶等）等，含有較多的氨基酸，有豐富的營養(yǎng)成分，易吸收。

　�。�2）植物性蛋白質(zhì)：主要來源于豆制品（豆腐、豆皮、豆?jié){等）或者是谷類（大米、小麥、小米等）等食品，含有不同含量的植物蛋白質(zhì)。

　　2.營養(yǎng)學(xué)分類

　　（1）完全蛋白質(zhì)中所含氨基酸相比較來說品種比較多，數(shù)量也充足，比如：奶制品、蛋類、動物肝臟等食物中的蛋白質(zhì)。

　�。�2）不完全蛋白質(zhì)含有氨基酸種類和數(shù)量都比較少，例如動物明膠、玉米膠蛋白。

　�。�3）半完全蛋白質(zhì)氨基酸種類也比較多，但相比較來說含量不足，比如麥膠蛋白中的成份。

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